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　　噻唑藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品MTT主要有兩個(gè)用途

　　1.藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測(cè)定;

　　2.細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測(cè)定。

　　噻唑藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)步驟：

　　1：接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul.

　　2:培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。

　　3：呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ulDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。

　　4：比色：選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

　　注意事項(xiàng)

　　1.選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度，保證細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束時(shí)濃度不至于過滿。

　　2.種板技術(shù)：均勻。

　　3.實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，溶媒孔，加藥孔。

　　調(diào)零孔：培養(yǎng)基、MTT、DMSO。（無細(xì)胞）

　　溶媒孔：培養(yǎng)液、MTT、DMSO、細(xì)胞、溶酶。

　　加藥孔：培養(yǎng)液、MTT、DMSO、細(xì)胞、不同濃度的藥物。

　?。ㄒ话?-7個(gè)梯度，設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔）

　　4.避免血清干擾：一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。

　　5.邊緣效應(yīng)：周邊孔加入PBS。

　　6.MTT的配置：MTT0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液。4℃下避光保存2周。

　　7.孔板的重復(fù)利用（1.做完MTT后用大水流盡量將板沖凈，然后用洗衣粉水泡幾個(gè)小時(shí)（小心讓洗衣粉先化開）。2.用自來水沖凈洗衣粉水，倒扣晾干.3.重鉻酸鉀加濃硫酸配成的酸液中浸泡過夜泡洗液（六小時(shí)以上即可）后自來水洗凈（20次左右）每個(gè)孔都要處理4.用去離子水沖洗3遍，雙蒸水沖洗3遍，烤干5.超凈臺(tái)中紫外線照射2個(gè)小時(shí)左右，就可以用了，不可以高壓。或泡酸過夜，dd水沖洗干凈，烘干或者晾干后紫外照射30min以上即可使用。

　　8.MTT法只能用來檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。

　　9.在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT吸光度在0-0.7范圍內(nèi)。

　　10.MTT有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件帶那種透明的簿膜手套。

　　11.配成的MTT需要無菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉。