微生物培養(yǎng)基的配制與滅菌的基本步驟
更新時間：2021-08-27 點(diǎn)擊次數(shù)：6072次
目前培養(yǎng)基是微生物測定的基礎(chǔ)，而培養(yǎng)基本身的質(zhì)量好壞就成了保證微生物實驗成功的關(guān)鍵因素。培養(yǎng)基需要合理的制備、貯存、培養(yǎng)基的質(zhì)量檢驗還能確保提供持續(xù)高質(zhì)量的培養(yǎng)基。在按照可接受的來源和標(biāo)準(zhǔn)中的配方制備培養(yǎng)基的過程中，重要的是選擇正確的培養(yǎng)基和成分。與脫水和制備好的培養(yǎng)基一起的還常常伴有供應(yīng)商的配方和說明。
微生物實驗中培養(yǎng)基的配置應(yīng)該注意的幾大步驟：1、常用玻璃儀器的準(zhǔn)備制備培養(yǎng)基所用的吸管、錐形瓶、毛細(xì)吸管、平皿等玻璃儀器用前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用。（1）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內(nèi)，于121℃高壓蒸汽菌3min后烘干，備用。（2）試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報紙包扎好，121℃高壓蒸汽滅菌20℃后烘干，備用。（3）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽內(nèi)的氣體污染），然后用紙包后或裝入金屬吸管筒內(nèi)，于121℃高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用。其他玻璃器皿均應(yīng)按上法處理，也應(yīng)裝金屬筒內(nèi)160℃干熱滅菌2h后，備用。
2、培養(yǎng)基的制備及儲存（1）溶化：一般應(yīng)放在玻璃器皿或搪瓷齊內(nèi)。加入蒸餾水，隔水加熱以促其溶解，加熱時應(yīng)經(jīng)常攪拌，防止焦結(jié)，待其溶解后補(bǔ)足水分。在使用干燥培養(yǎng)基時，先將蒸餾水按定量加入容器中，然后稱取一定量培養(yǎng)基干粉放入水中，靜置10—15min，攪拌，振蕩，或延長時間以促進(jìn)溶解，一般不要熱，必要時加熱，但時間不宜過長，溫度不宜過高，避免某些營養(yǎng)成分被破壞。（2）校正酸堿度（調(diào)節(jié)pH）：培養(yǎng)基必須有適當(dāng)?shù)膒H。因此測定pH是培養(yǎng)基配制過程中的重要步驟之一，測定pH的標(biāo)準(zhǔn)溫度為25士2℃。調(diào)節(jié)pH可用無菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液。當(dāng)調(diào)節(jié)緩沖液的pH時，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液。滅菌后的pH會比滅菌前的pH升高或降低，一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH會比最終pH調(diào)高0.2左右，滅菌后基本合適。因此對培養(yǎng)基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進(jìn)行測定，并記下每次pH的測定結(jié)果，有助于積累數(shù)據(jù)考察每種培養(yǎng)基、緩沖液、試劑對滅菌程序的耐受性，從而指導(dǎo)滅菌前pH的調(diào)節(jié)。干燥培養(yǎng)基一般已校正過pH，用時也必須再驗證。測定時，一般用指示劑滴入培養(yǎng)基觀察其顏色的變化，或用pH計校正，如與所需pH不符，可用以上的酸或堿液加以校正。調(diào)整pH后要加熱過濾，使培養(yǎng)基澄清。
（3）培養(yǎng)基的分裝：大批量配制時使用的自動分配器須經(jīng)校準(zhǔn)和確認(rèn)。每次使用前后，均要對分配器的管道系統(tǒng)進(jìn)行沖洗，在分裝無菌培養(yǎng)基前，則要采用無菌硅膠管。固體培養(yǎng)基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據(jù)需要分裝平皿或試管。平皿：傾注平皿，應(yīng)在無菌室中放置3—4h，如用塑料平皿須在35℃培養(yǎng)箱 中倒置30—60min。讓水蒸汽自然蒸發(fā)。斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積1/5，滅菌后趁熱斜放在細(xì)玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝使注意管口和瓶塞上勿沾有培養(yǎng)基，如沾有培養(yǎng)基應(yīng)用布抹去，以避免污染。高層斜面：制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應(yīng)用。分裝好的培養(yǎng)基或緩沖液等及時密封后必須在配制當(dāng)天（2h內(nèi)最佳）進(jìn)行滅菌處理。液體、半固體培養(yǎng)基一般在高壓滅前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加其他成分的液體、半固體培養(yǎng)基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中。
培養(yǎng)基的滅菌：培養(yǎng)基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養(yǎng)基的滅菌時間和壓力，按其成分不同而定。普通培養(yǎng)基采用121℃、103.42kPa滅菌15min，但容器和裝量較大時，應(yīng)延長至20min。含糖培養(yǎng)基115℃、68.85kPa滅菌30min。含糖、血清、 雞蛋等培養(yǎng)基可用流動蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，連續(xù)3d，間歇滅菌。血清或組織液，采用低熱56—58水浴1h，連續(xù)5—6d滅菌，一些遇高溫即被破壞的物質(zhì)如尿素、腹水等，可用細(xì)菌過濾器，過濾除菌。高壓滅菌應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程執(zhí)行，必須逐漸加熱，*排除滅菌器內(nèi)的空氣，再逐漸升壓保持預(yù)定的壓力和時間，達(dá)到全部殺滅微生物。以上的滅菌時間和溫度要經(jīng)過驗證確認(rèn)，如不同類型培養(yǎng)基混合一起滅菌時宜采用115℃、68.85kPa滅菌30min為好。通過無菌技術(shù)為測試制備的每一批培養(yǎng)基其PH在放冷至室溫（25°）后，都應(yīng)測定。一個扁平的pH計用于培養(yǎng)基表面pH值的測定，浸入式的pH計用于液體的測定。各供應(yīng)商提供的培養(yǎng)基的pH應(yīng)該在規(guī)定的±0.2的范圍內(nèi)，除非通過驗證得到更寬的范圍
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