真菌長期保藏過程中生理生化性狀的影響
更新時間：2021-10-19 點擊次數(shù)：463次
對于一些病原菌來說，真菌長期保藏過程中如何避免致病力的喪失成為最大的難題，真菌長期保藏過中，致病力下降的報道較多。Kelly 等發(fā)現(xiàn)Fusarium oxysporum f.sp. ciceris經(jīng)過六年的在PDA培養(yǎng)基上大量的轉(zhuǎn)接后在接種到鷹嘴豆上沒有致病力[10]。一些保藏在蒸餾水中的Phytothphora 菌株經(jīng)過長期保藏后也喪失了致病性[11]。Ryan 和 Ellison [12] 用原位結(jié)合超低溫保藏的技術(shù)方法對Puccinia spegazzinii菌株進(jìn)行了保藏處理，經(jīng)過保藏后的菌株依然有產(chǎn)生擔(dān)孢子的能力，但對寄主侵染能力下降，在葉柄的侵染沒有成功。一些昆蟲和植物的病原菌如果不經(jīng)過回接到寄主昆蟲或植物，也會逐漸喪失其致病性。Mota等[13]驗證了Arthrobotrys robusta和 Monacrosporium thaumasium菌株結(jié)合線蟲的不同保藏工藝處理對捕食線蟲能力的影響，發(fā)現(xiàn)添加保護(hù)劑可以提高Arthrobotrys robusta和 Monacrosporium thaumasium菌株防治線蟲的能力。López Lastra等[14]對一些Hyphomycetes Entomophthorales Trichomycetes和 Oomycetes的9株內(nèi)生病原真菌進(jìn)行了18個月的長期保藏的試驗，并在第3、6、12、18個月分別監(jiān)測保藏菌株的活性及其侵染性，Paecilomyces fumosoroseus菌株蒸餾水、礦油、-20℃和-80℃保藏等幾種保藏方法都適合，Smittium culisetae 和 Leptolegnia chapmanii 菌株只適合于蒸餾水和礦油保藏。Tommerup用凍干法保藏VA真菌，并監(jiān)測了其孢子萌發(fā)能力、菌絲生長能力以及定殖能力[15]。對于一些菌株的致病性等能力的喪失，可以用一些酶活和代謝產(chǎn)物的指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測[16]。Shinohara 等[17]發(fā)現(xiàn)，用于釀酒的Saccharomyces cerevisiae 菌株經(jīng)過多次的斜面轉(zhuǎn)接后，引起了酒品質(zhì)的變化。
真菌次級代謝產(chǎn)物一直是真菌學(xué)研究利用的重點，真菌可以產(chǎn)生一系列的次級代謝產(chǎn)物[18]， 并且一些典型的代謝產(chǎn)物可以用于真菌類群的劃分[19]。Svendsen 和 Frisvad報道次級代謝產(chǎn)物chemosystematics應(yīng)用聚類分析分析279株青霉真菌到種的水平上[20]。對于真菌次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)菌株來說，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物功能的穩(wěn)定性保藏及其重要，但是真菌在保藏及其生產(chǎn)等過程中可能喪失產(chǎn)生某一種代謝產(chǎn)物的能力。Svendsen 和 Frisvad發(fā)現(xiàn)兩株P(guān)enicillium comembertii 喪失了產(chǎn)橘霉素的能力（citrinin）[20]，這兩株菌Bridge 等報道能夠產(chǎn)生橘霉素[21]。真菌菌株發(fā)生退化可能是真菌產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的情況發(fā)生了改變[22]、[23]。Ryan在對Metarhizium anisopliade 和 Fusarium oxysporum 菌株進(jìn)行保藏處理后發(fā)現(xiàn)次級代謝的產(chǎn)生情況發(fā)生了改變[20]，菌株產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的能力對保藏過程極為敏感，多數(shù)的保藏物與保藏前的次級代謝產(chǎn)物情況發(fā)生了改變，產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性隨著保藏時間的延長而降低。經(jīng)過兩年的保藏，斜面轉(zhuǎn)接保藏方法保藏的菌株M. anisopliade 和 F. oxysporum都喪失了產(chǎn)生胞外次級代謝物的特點，而用其它保藏方法的一部分菌株產(chǎn)生某些次級代謝產(chǎn)物的特點得以保存。在Ryan[16]研究中還發(fā)現(xiàn)，真菌的保藏方法對于菌株的次級代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性保藏局限于“株"的水平上，對于同一種的不同菌株來說，同一保藏方法處理，得到的保藏結(jié)果可能就不一樣。真菌的次級代謝產(chǎn)物可以應(yīng)用于分類學(xué)、教學(xué)研究以及應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，長期保藏過程中菌株次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生情況發(fā)生改變，帶來的后果將是十分嚴(yán)重。
真菌有產(chǎn)生多種胞外酶利用多種類型底物的能力，真菌酶作用機理、酶制劑的研究開發(fā)歷來受到重視，一些誘導(dǎo)酶，如脂肪酶、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶等具有降解復(fù)雜大分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)的能力，在昆蟲、植物病害的生物防治中具有重要作用?；盍φ婢L期保藏對酶活力變化的影響長期存在。一些商業(yè)開發(fā)的檢測板，如APTZYM、API50CH以及Biolog檢測板可以用于分析真菌胞外酶活的變化情況[16] [24] [25] [26]。Ryan在研究M. anisopliade 和 F.oxysporum發(fā)現(xiàn)，其胞外酶的分泌能力在長期保藏過程中發(fā)生改變，而酶活力是菌株生理穩(wěn)定性重要指標(biāo)，不同保藏方法對酶活力的穩(wěn)定性同樣體現(xiàn)在“株"的水平上，而不是“種"的水平[16]。Ryan在F. oxysporum菌株兩年的保藏試驗中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的分離物喪失了α-甘露糖苷酶或β-木聚糖酶活性，殼二糖酶、葡聚糖酶和阿拉伯糖酶活性偶爾喪失[16]。M. anisopliade在兩年的低溫保藏試驗中，喪失了β-galacosidase α-fucosidase β-chitobiosidase β-glucuronidase的活性。M. anisopliadeM1菌株的leucine arylamidasde的活性在所有經(jīng)過蒸餾水保藏的分離物中能夠檢測到，而在凍干和低溫保藏的分離物中部分能夠檢測到leucine arylamidasde的酶活。而對于tryspin的酶活檢測，在-20℃的低溫保藏處理和蒸餾水的保藏tryspin的酶活力情況保藏最好。
分子生物學(xué)在近20年的時間里發(fā)展較快，基于PCR技術(shù)使真菌長期保藏后的基因信息完整性檢測成為可能，如果真菌在保藏過程中基因信息發(fā)生缺失的話，那就有可能真菌的一些有價值的生理性狀、產(chǎn)酶能力遭到破壞。對于模式菌保藏過程中基因信息的缺失，在分子信息的分類研究中，*有可能影響分類學(xué)的研究結(jié)果。Kumata等[27]注意到來自不同菌種保藏中心的同一個Trichoderma菌株，在PCR分子指紋分析中，得出了相偏離的結(jié)果。Kelly 等在對保藏了12年的F. oxysporum f.sp. ciceris菌株的一個分離物與其它分離物相比，沒有顯現(xiàn)出應(yīng)有的典型分子特征[10]。Horgen結(jié)合RFLP與染色體分析，研究了Agaricus bisporus 菌株染色體丟失、退化情況[28]。Shinohara 等發(fā)現(xiàn)Saccharomyces cerevisiae 在450天內(nèi)經(jīng)過150次的轉(zhuǎn)接，菌株的染色體核型發(fā)生了微小的變化[17]。F. oxysporum f.sp.niveeum 菌株在連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)DNA的甲基化現(xiàn)象[7]。斜面轉(zhuǎn)接、油管等保藏方法的機理是降低菌株的代謝速率，而凍干、超低溫保藏的機理是停止細(xì)胞代謝，目前對細(xì)胞代謝停止、恢復(fù)代謝后真菌基因信息、染色體信息是否完整的研究報道較少。
避免真菌菌株在保藏過程中形態(tài)特征、生理生化性狀、基因信息的發(fā)生變化對于菌株的工業(yè)化生產(chǎn)、分類、教學(xué)研究具有重要意義。雖然真菌菌株在長期保藏中不可避免的出現(xiàn)致病力下降、酶活力下降、酶活性丟失，但從Ryan 等人的研究中可以發(fā)現(xiàn)，采用不同的保藏程序方法可以不同程度的降低菌株長期保藏過程中退化。此外，菌株在致病活性、酶活力性狀的長期保藏對保藏工藝選擇性體現(xiàn)在“株"的水平上，同一個種菌種的不同菌株也需要進(jìn)行保藏工藝的研究才能保證其形態(tài)特征、生理生化特征的穩(wěn)定遺傳。對于一些真菌菌株誘導(dǎo)酶活性的丟失，一般情況下只要真菌菌株基因信息完整，在加入相應(yīng)誘導(dǎo)物，真菌菌株會可能重新恢復(fù)一定的產(chǎn)酶能力，但酶活力的產(chǎn)量是否得到恢復(fù)視具體情況而定。對于一些生產(chǎn)性的真菌菌株或工程菌株來說，多是經(jīng)過誘變、基因重組、基因突變或轉(zhuǎn)基因等手段得到，其基因組的穩(wěn)定性相對于野生菌株來說，穩(wěn)定性可能下降，此類菌株在長期保藏的過程中需要特殊的保藏工藝處理，才能夠保證基因信息的穩(wěn)定遺傳。
在線客服