真菌的保藏技術(shù)方法很多，但沒有一種保藏工藝能夠適合所有真菌種類的保藏。Ryan等(2002)從科學(xué)、供應(yīng)以及財(cái)政等角度制定了一些原則來指導(dǎo)保藏者選擇合適的保藏技術(shù)。一些基本的保藏方法，如斜面移植法、油管保藏法、蒸餾水保藏法、沙土管保藏法、硅膠保藏法等文獻(xiàn)已經(jīng)為一些真菌的保藏提供選擇，不再進(jìn)行贅述（Smith & Onions, 1994; Fenell, 1960; Smith et al., 2001; Boesewinkel, 1976; Burdsall, 1994; Perkins, 1962)。以下僅對(duì)真菌的冷凍干燥、超低溫凍結(jié)、液氮保藏、固定化和玻璃化保藏技術(shù)及進(jìn)展進(jìn)行概述。
冷凍干燥保藏技術(shù)（Freeze drying）
真菌的冷凍干燥保藏技術(shù)包括三個(gè)主要步驟，一是要培養(yǎng)物冷凍階段；二是冷凍的狀態(tài)下的減壓干燥，干燥過程必須避免液體狀態(tài)，溫度應(yīng)保證在-15℃以下，避免溫度反復(fù)起伏，控制培養(yǎng)物的水分到5%左右為宜；最后進(jìn)行真空镕封，在低溫、避光的環(huán)境下保藏（Smith, 1983)。冷凍干燥過程中的重要環(huán)節(jié)是避免低溫傷害，低溫傷害在冷凍和干燥時(shí)段都有發(fā)生, 其原理可能是細(xì)胞膜上液體的結(jié)晶體向膠體階段轉(zhuǎn)變的時(shí)候，引起細(xì)胞膜流動(dòng)鑲嵌結(jié)構(gòu)的損害(Tan, 1997)。一些保護(hù)劑的應(yīng)用，如血清、脫脂乳、肌糖、海藻糖以及蛋白胨的應(yīng)用可以降低這種傷害。采用該技術(shù)保藏的微生物菌株有分發(fā)時(shí)不用事先開啟、便于包裝、降低運(yùn)輸過程的泄漏危險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)。冷凍干燥保藏技術(shù)適用于一些產(chǎn)孢子的真菌，特別是一些能夠產(chǎn)生子囊孢子和分生孢子的真菌，保藏周期可到20-40年。Tan等采用該技術(shù)對(duì)真菌的菌絲進(jìn)行保藏復(fù)活研究，大多數(shù)情況下，得不出的滿意的結(jié)果，(Tan, 1991 )，目前僅有Pertot等 (1977)報(bào)道Claviceps spp菌絲可經(jīng)過冷凍干燥保藏后復(fù)活。
超低溫保藏技術(shù)
超低溫保藏一般分為兩種方式，一是超低溫冰箱保藏，保藏溫度一般為-70- -80℃；另一種方式為液氮超低溫保藏，根據(jù)液氮罐的構(gòu)造類型，可分為隔氮式和浸氮式，隔氮式是將保藏物保藏于氣相中，保藏溫度一般在-135℃左右，浸氮式是將保藏物保藏在液氮的液面之下，保藏溫度為-196℃。Herry于1663年發(fā)現(xiàn)將一些線蟲經(jīng)過冷凍并通過溶化過程使之復(fù)活（Morris, 1981），Polge等(1949) 首先將此技術(shù)成功應(yīng)用保藏鳥類，Hwang（1960）將此技術(shù)應(yīng)用于真菌的保藏。液氮超低溫保藏技術(shù)有三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)影響著真菌的保藏效果，一是降溫速率控制理論上保藏前的降溫速率控制越慢越好，1℃/mins降溫速率已*適合大多數(shù)種類真菌的保藏。二是復(fù)活過程中保藏物快速升溫到最適溫度，目前處理的方法將保藏的凍存管快速置于37-45℃水浴中，放置1-2分鐘。三是保護(hù)劑的種類和濃度選擇，常用的保護(hù)劑有甘油、海藻糖、DMSO等。
降溫速率的控制和保護(hù)劑的配合使用是為了降低低溫?fù)p害風(fēng)險(xiǎn)（Smith & Thomas 1998）。Smith（1983）認(rèn)為真菌的低溫傷害是由于細(xì)胞組織被冰晶破壞和細(xì)胞內(nèi)濃度增高等幾方面互相作用的結(jié)果。Merryman 等 (1977)認(rèn)為細(xì)胞的緩沖液的快速波動(dòng)引發(fā)pH的變化，細(xì)胞內(nèi)大分子失水的過程中可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部結(jié)晶化，引起細(xì)胞皺褶等原因?qū)е录?xì)胞死亡。細(xì)胞膜的破壞是細(xì)胞死亡的真正原因，Roquebet & Bury(1993) 在研究Lentinula edodes 菌株降溫過程時(shí)認(rèn)為冰晶對(duì)細(xì)胞膜的物理破壞作用可能是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的直接原因。
Ryan & Smith （2003）在對(duì)Phytophthora的保藏研究中，比較了10%的DMSO及降溫速率1℃/mins和10%甘油保護(hù)劑及降溫速率10℃/mins兩種保藏工藝，在10%的DMSO及降溫速率1℃/mins 的試驗(yàn)中，67個(gè)分離物中65個(gè)分離物具有活性，存活率達(dá)92.5%；而在10%的甘油及降溫速率10℃/mins的試驗(yàn)中，保藏后檢測(cè)到到了卵孢子和厚垣孢子的形成，沒有卵孢子形成的分離物依然有菌絲的生長(zhǎng)。Ryan & Smih在用10%甘油保護(hù)劑及降溫速率10℃/mins的保藏工藝用于Diploccarpon rosae 和 Moniliophthora roreri時(shí)，保藏的成活率低于50%。為了提高M(jìn)oniliophthora roreri 菌株的孢子產(chǎn)量，所有的菌株在進(jìn)行超低溫保藏前事先放在冰箱中低溫處理21d，在此后的活性檢測(cè)中，成活率達(dá)到了91%，比先前的成活率提高了41%。用不同的保護(hù)劑，如海藻糖、甘油、DMSO、肌糖、蛋白胨等，對(duì)Serpula lacrymans 進(jìn)行了保藏處理，各保護(hù)劑處理保藏效果的差異不明顯，DMSO的保藏，成活率達(dá)到了89%。液氮的超低溫保藏目前認(rèn)為是*的保藏方法，但對(duì)于一些真菌來說，雖然在保護(hù)劑和降溫速率控制方面進(jìn)行了較多的研究，但保藏效果依然不好，例如一些擔(dān)子菌類以及Straminipila、Phytophthora、Saprolegnia屬等。
玻璃化技術(shù)（Vitrification）
超低溫保藏技術(shù)過程必然要經(jīng)過“玻璃化"過程?！安ＡЩ?技術(shù)實(shí)質(zhì)就是讓水分子處于一種類似于固體狀態(tài)而不發(fā)生結(jié)晶，可以通過空氣干燥、化學(xué)物質(zhì)干燥蒸發(fā)水分，滲透濃脫水、海藻鹽包裝脫水、化學(xué)保護(hù)劑等手段實(shí)現(xiàn)“玻璃化"。一是部分的“玻璃化"過程和全部的“玻璃化"過程。部分的玻璃化過程，主要控制細(xì)胞膜外的水分結(jié)晶，減少細(xì)胞破壞，全部“玻璃化"過程要*阻止細(xì)胞內(nèi)、外冰晶的形成。玻璃化保藏技術(shù)在多細(xì)胞組織保藏中應(yīng)用較廣，是用高濃度的保護(hù)劑溶液保護(hù)保藏物，使之在降溫過程中以“玻璃體"形式存在，從而避免冰晶對(duì)細(xì)胞組織的破壞。此外，在恢復(fù)培養(yǎng)的過程中注意避免晶狀體破碎和及時(shí)洗掉對(duì)真菌有毒的玻璃化溶液。Ryan & Smith （2002）報(bào)道了應(yīng)用此法成功保藏一些真菌，如Flammulina Boletus Mycena 等屬的一些菌種，而對(duì)Phytophthora和 Sarpolegnia 保藏的檢測(cè)結(jié)果是全部死亡，與常規(guī)應(yīng)用的一些方法相比，高濃度玻璃化溶液對(duì)大多數(shù)真菌是有毒的，不利于真菌菌株的長(zhǎng)期保藏。
固定化技術(shù)（Immobilisation）
固定化的保藏技術(shù)是將真菌菌株事先包裹在藻酸鈣中并進(jìn)行超低溫保藏一種保藏技術(shù)。固定化的技術(shù)方法已用于真菌酶制劑、生防菌株、生物降解等多個(gè)方面的研究（Kwak & Rhee, 1992; Pereira & Roberts, 1991; Lestan et al, 1998; Walker & Connick, 1983），用藻酸鈣誘捕固定真菌的也有多方面的報(bào)道（Walker & Connick, 1983; Mauperin, et al.,1987; Pereira & Roberts, 1991; Kwak & Rhee, 1992; Daigle & Cotty,1997）。Abdullah等 （1995）發(fā)現(xiàn)固定化的技術(shù)并不對(duì)真菌的菌絲造成傷害，可以擴(kuò)展用固定化的技術(shù)應(yīng)用于真菌的長(zhǎng)期保藏。Smith等 (1992) 建議可應(yīng)用于一些擔(dān)子菌、卵菌以及一些不產(chǎn)孢真菌的保藏。
固定化保藏真菌技術(shù)基本過程包括，第一步制備真菌的孢子或菌絲的藻酸鹽的懸浮液；第二步是滴入藻酸鈣的溶液中，此時(shí)真菌孢子或菌絲體會(huì)包裹在形成的藻酸鈣的小球中，并放置一段時(shí)間；第三步將菌絲或孢子小球轉(zhuǎn)移到高滲溶液中進(jìn)行脫水；第四步可以按照真菌保藏的一些常規(guī)方法保藏，如液氮超低溫保藏、油管保藏、蒸餾水保藏等。
Gilson等(1990)注意到將固定化的小球放置在藻酸鈣的溶液中放置一段時(shí)間，可以防止小球破裂。Abdullah等（1995）用固定化的技術(shù)對(duì)8株擔(dān)子菌的菌絲進(jìn)行了保藏，一年后監(jiān)測(cè)仍有活性。Mauperian等(1987)報(bào)道用固定化的方法對(duì)外生菌根菌的菌絲進(jìn)行保藏，4℃冰箱中用蒸餾水保藏法，活性至少保持了5個(gè)月。Ryan （2001）用固定化的方法處理Serpula lacrymans 菌絲，并分別做了在-20℃冰箱和20℃蒸餾水保藏兩種處理，經(jīng)過一個(gè)月的保藏，經(jīng)過固定化處理的菌絲活性顯著高于對(duì)照處理。Wood等（2000）報(bào)道用固定化技術(shù)和超低溫保藏相結(jié)合的方法對(duì)Dactylorhzia fuchsia and Anacampis morio 的種子以及種子上附帶的擔(dān)子菌Ceratobasidium cornigerum菌絲進(jìn)行保藏處理，保藏效果良好。
真菌保藏技術(shù)研究方向是提高菌株的存活率和穩(wěn)定性、開拓保藏范圍，特別是對(duì)不能培養(yǎng)的專一寄生菌，如銹菌以及Halophythora Saprolegnia Aphanomyces 屬的菌種，以及Basidiomycota 和 Glomeromycota 中一些種開展保藏技術(shù)研究。Ryan & Ellison (2002) 用原位結(jié)合超低溫保藏的技術(shù)方法對(duì)Puccinia spegazzinii菌株進(jìn)行了保藏處理，經(jīng)過保藏后的菌株依然有產(chǎn)生擔(dān)孢子的能力，雖然對(duì)寄主侵染能力下降，在葉柄的侵染沒有成功，但顯示了固定化和超低溫保藏結(jié)合對(duì)保藏一些不易保藏真菌有應(yīng)用的潛力，如內(nèi)生真菌、地衣、菌根菌、不能培養(yǎng)的真菌等。多數(shù)的研究者專注于真菌分類學(xué)、酶學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科進(jìn)展，專注于發(fā)現(xiàn)新的功能基因、生物大分子以及基因、生物大分子的代謝調(diào)控功能等，而忽視研究菌株的穩(wěn)定性、基因完整性的安全長(zhǎng)期保藏，一旦由于管理或保藏技術(shù)的原因，致使菌株丟失、變異、退化，其先前的研究成果也就不復(fù)存在，將重要菌株通過一定的手續(xù)存放于專業(yè)的菌種保藏機(jī)構(gòu)是可行的一種選擇。
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